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Les myofibroblastes LRRC15+ dictent le point de consigne stromal pour supprimer l'immunité tumorale

Jun 24, 2023

Nature volume 611, pages 148–154 (2022)Citer cet article

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Des études unicellulaires récentes sur le cancer chez la souris et l'homme ont identifié l'émergence d'une population de myofibroblastes spécifiquement marquée par la protéine 15 contenant des répétitions riches en leucine hautement restreinte (LRRC15)1,2,3. Cependant, les signaux moléculaires qui sous-tendent le développement des fibroblastes associés au cancer (CAF) LRRC15+ et leur impact direct sur l'immunité anti-tumorale ne sont pas caractérisés. Ici, dans des modèles murins de cancer du pancréas, nous fournissons des preuves génétiques in vivo que la signalisation du récepteur TGFβ de type 2 dans des fibroblastes universels dermatopontine+ sains est essentielle pour le développement de myofibroblastes LRRC15+ associés au cancer. Cet axe entraîne également principalement la diversité de la lignée des fibroblastes dans les cancers humains. En utilisant des souris knock-in nouvellement développées pour le récepteur de la toxine diphtérique Lrrc15 pour épuiser sélectivement les CAF LRRC15 +, nous montrons que l'épuisement de cette population réduit considérablement le contenu total en fibroblastes tumoraux. De plus, la composition du CAF est recalibrée vers les fibroblastes universels. Cela soulage la suppression directe des lymphocytes T CD8 + infiltrant la tumeur pour améliorer leur fonction effectrice et augmente la régression tumorale en réponse au blocage du point de contrôle immunitaire anti-PDL1. Ensemble, ces résultats démontrent que les CAF LRRC15 + dépendants du TGFβ dictent le point de consigne tumeur-fibroblaste pour favoriser la croissance tumorale. Ces cellules suppriment également directement la fonction des lymphocytes T CD8 + et limitent la réactivité au blocage des points de contrôle. Le développement de traitements qui rétablissent le point de consigne homéostatique des fibroblastes en réduisant la population de myofibroblastes pro-maladie LRRC15+ pourrait améliorer la survie des patients et la réponse à l'immunothérapie.

Les CAF jouent un rôle clé dans la formation du microenvironnement tumoral (TME) et la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse4,5,6. Des études antérieures sur les données d'expression génique des tumeurs de patients ayant reçu des thérapies de blocage des points de contrôle immunitaires (ICB) ont déduit une association entre l'abondance de CAF et l'absence de réponse à l'immunothérapie7,8. Les agents thérapeutiques qui ciblent de manière appropriée les CAF peuvent atténuer cette résistance, mais restent limités en raison d'une compréhension incomplète de l'hétérogénéité des CAF et de l'identification de sous-ensembles cliniquement pertinents. L'utilisation du séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) a augmenté la résolution du paysage cellulaire stromal dans les tissus sains et malades. Les analyses scRNA-seq de l'évolution des CAF dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) et le cancer du sein ont identifié une prédominance de myofibroblastes activés (chez les souris et les humains) marqués par LRRC15 (réfs 1,2,3). Cette population CAF exprime une multitude de gènes associés à la matrice extracellulaire et à l'immunosuppression1,9,10. Cliniquement, une expression élevée d'une signature génétique LRRC15 + CAF dans les données de séquençage d'ARN en masse de patients atteints de cancer était associée à une absence de réponse au ligand de mort programmé 1 (PDL1) ICB1. On ne sait toujours pas si les CAF LRRC15+ sous-tendent cette absence de réponse ou s'ils représentent une lecture des caractéristiques intrinsèques à la tumeur qui motivent l'association. Il manque également la justification in vivo des signaux cellulaires et moléculaires qui favorisent le développement des myofibroblastes LRRC15+ et leur impact direct sur l'immunité anti-tumorale.

Des études récentes de scRNA-seq utilisées dans les prédictions silico pour associer la signalisation active du TGFβ à la formation de myofibroblastes LRRC15 + au cours de la tumorigenèse1,3. Des études d'atlas unicellulaires distinctes ont déduit que des sous-ensembles de fibroblastes activés dans des tissus perturbés se développent à partir de fibroblastes universels pantissulaires10. Nous avons cherché à fournir un lien génétique in vivo entre ces deux inférences, en proposant que la signalisation TGFβ dans les fibroblastes universels est indispensable à la formation de myofibroblastes LRRC15+ au cours de la progression tumorale. Nous avons utilisé un système de souris ciblant la dermatopontine (DPT), une protéine de la matrice extracellulaire qui marque les fibroblastes universels10. Des souris DptIresCreERT2 ont été croisées avec des souris floxées du récepteur TGFβ de type 2 (TGFβR2, codé par Tgfbr2) (DptIresCreERT2Tgfbr2fl / fl) pour générer un knock-out inductible et conditionnel de Tgfbr2 dans les fibroblastes universels DPT + (Fig. 1a, en haut). Des souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl (témoin) ou Dptki/kiTgfbr2fl/fl (invalidation conditionnelle Dpt) ont été placées sous un régime de tamoxifène (TAM) et implantées par voie sous-cutanée avec KPR3070 (KPR ; KrasLSL.G12D/wt ; p16/p19fl/wt ; p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre) Cellules tumorales PDAC1,11. Les tumeurs ont été prélevées 21 jours après l'implantation pour une analyse par cytométrie en flux (Fig. 1a, en bas). Pour assurer une élimination efficace de Tgfbr2, le même schéma TAM (décrit à la Fig. 1a) a d'abord été réalisé chez des souris rapporteurs DptIresCreERT2Rosa26LSLYFP portant des tumeurs KPR sous-cutanées. Cela a été fait pour comprendre quelle proportion de fibroblastes tumoraux sont dérivés de cellules DPT+, une population de fibroblastes abondante dans les tissus cutanés naïfs10. Après 21 jours d'implantation, la plupart (environ 84 %) des fibroblastes PDPN+ dans les tumeurs étaient YFP+ (Extended Data Fig. 1a). À son tour, l'expression de TGFβR2 sur les CAF PDPN + des tumeurs Dptki / kiTgfbr2fl / fl a été réduite d'environ 90% par rapport aux tumeurs Dptwt / wtTgfbr2fl / fl (données étendues Fig. 1b). En conséquence, les tumeurs Dptki/kiTgfbr2fl/fl présentaient une réduction significative du nombre total de CAF LRRC15+PDPN+ par rapport aux tumeurs témoins Dptwt/wtTgfbr2fl/fl, ce qui indique que les cellules LRRC15+ dépendent de la signalisation TGFβR2 dans les cellules DPT+ pour leur formation (Fig. 1b, c). Malgré la réduction significative des cellules LRRC15 + dans les tumeurs Dptki / kiTgfbr2fl / fl, le nombre total de fibroblastes PDPN + CD31– était inchangé entre les deux groupes, ce qui indique qu'un mécanisme de compensation s'est produit pour maintenir le compartiment CAF (Fig. 1d).

a, Schéma de l'approche génétique (en haut) et expérimentale (en bas) pour la génération de souris DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl. sc, sous-cutané. b–g, les données proviennent de tumeurs KPR sous-cutanées 21 jours après l'implantation chez des souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl et Dptki/kiTgfbr2fl/fl. b, Parcelles représentatives de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules PDPN + LRRC15 +. Les cellules ont été fermées sur des cellules PDPN + CD31–. c,d, Quantification du nombre total de cellules PDPN+LRRC15+ (c) et PDPN+CD31– (d) normalisé par le poids de la tumeur (n = 12 souris). e, Terrain d'approximation et de projection multiples uniformes (UMAP) de 6 525 fibroblastes uniques colorés par l'appartenance au cluster (à gauche, n = 5 souris par groupe) et l'expression moyenne relative des gènes marqueurs indiqués dans les clusters (C0 – C5) de l'UMAP (à droite ). f, UMAP comme dans e divisé par génotype. g, UMAP comme dans e divisé par génotype et coloré par l'expression de Lrrc15. h–j, Les données proviennent de tumeurs KPR pancréatiques orthotopiques 15 jours après l'implantation chez des souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl ou Dptki/kiTgfbr2fl/fl h, Parcelles représentatives de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules PDPN+LRRC15+. Les cellules ont été fermées sur des cellules PDPN + CD31–. i,j, Quantification du nombre total de cellules PDPN+LRRC15+ (i) et PDPN+CD31– (j) normalisé par le poids de la tumeur (n = 11 ou 14 souris). k, Schéma de collecte des échantillons humains. NAT, tissu adjacent normal ; BLAD, carcinome urothélial de la vessie ; GYN, tumeurs gynécologiques ; PDAC, adénocarcinome canalaire pancréatique ; HNSC, carcinome épidermoïde de la tête et du cou ; SRC, sarcome ; KID, cancer du rein ; HEP, carcinome hépatocellulaire du foie ; CCR, cancer colorectal ; POUMON, cancer du poumon ; MEL, mélanome ; ADR, cancer de la surrénale ; PNET, tumeur neuroendocrine du pancréas ; GALL, cancer de la vésicule biliaire. l, PCA d'échantillons de cellules stromales. Les formes indiquent l'origine de l'échantillon ; les couleurs représentent l'indication du cancer. m, Chargements de gènes pour PC1 de l. n, Distribution d'échantillons provenant d'indications spécifiées à travers PC1 à partir de l. o, coefficient de corrélation de Pearson (PCC) entre l'expression de LRRC15 et l'activité de la voie TGFβ dans les échantillons (cercles pleins). Ligne de régression linéaire (ligne pointillée). p, Graphique en forêt illustrant les rapports de risque de survie (HR) globaux du TGFβ CAF pour les indications TCGA spécifiées. Les données en c, d, i et j sont la moyenne ± sd Les données en c, d, i et j sont regroupées à partir de deux ou trois expériences indépendantes. Pour n, les moustaches représentent le minimum et le maximum, la boîte représente l'intervalle interquartile et la ligne centrale représente la médiane. Pour p, le point central montre le HR, les lignes représentent l'intervalle de confiance (IC) à 95 %. Les statistiques ont été calculées à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié (c, d, i, j) ou du modèle de régression des risques proportionnels de Cox (p).

Données source

Le maintien de la teneur totale en fibroblastes en l'absence de formation de CAF LRRC15+ dans les tumeurs Dptki/kiTgfbr2fl/fl a justifié une étude plus approfondie de la composition des fibroblastes chez ces souris. Le scRNA-seq a été réalisé sur des cellules stromales CD24–CD45– et des cellules immunitaires CD45+ des tumeurs Dptwt/wtTgfbr2fl/fl et Dptki/kiTgfbr2fl/fl (Extended Data Fig. 1c). Après contrôle qualité, réduction de la dimensionnalité et regroupement, quatre groupes principaux de cellules ont été identifiées, chacune représentée par des cellules provenant de plusieurs animaux (Extended Data Fig. 1d). Il s'agissait de cellules immunitaires (Ptprc +, également appelées Cd45 +), de cellules endothéliales (Pecam1 +, également appelées Cd31 +), de péricytes (Rgs5 +) et de fibroblastes (Lum +) (tableau supplémentaire 1). La concentration de notre analyse en aval sur les fibroblastes a révélé six clusters spécifiques à la CAF (Fig. 1e et Tableau supplémentaire 2) : un cluster Pi16+ qui exprimait fortement les marqueurs universels des fibroblastes (cluster 3) ; un cluster Cxcl12+ (cluster 2) ; un cluster de CAF Crabp1+ (cluster 1) ; un groupe qui exprimait fortement les marqueurs de prolifération (groupe 4) ; et deux groupes avec une expression Lrrc15 élevée (groupe 0) et faible (groupe 5) (Fig. 1e). Les clusters 0 et 5 exprimaient des marqueurs de myofibroblastes supplémentaires au-delà de Lrrc15, indicatifs de la signalisation TGFβ, tels que Acta2 et Tagln. Ces deux groupes ont également obtenu des scores élevés pour une signature du gène Tgfb CAF précédemment déduite à partir de modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) de PDAC1 (Extended Data Fig. 1e). Confirmant notre hypothèse selon laquelle la signalisation TGFβR2 dans les cellules DPT + est nécessaire au développement du CAF LRRC15 +, les groupes 5 et 0 étaient absents chez les souris Dptki / kiTgfbr2fl / fl (Fig. 1f). De plus, les animaux Dptki / kiTgfbr2fl / fl n'avaient presque aucune cellule exprimant Lrrc15, Acta2 ou Tagln (Fig. 1g et Extended Data Fig. 1f). L'absence de CAF LRRC15 + a entraîné une augmentation concomitante de l'abondance relative du cluster 3 de fibroblastes universels Pi16 + et du cluster 1 Crabp1 + chez les souris Dptki / kiTgfbr2fl / fl. Ce résultat corrobore nos conclusions selon lesquelles la teneur totale en fibroblastes tumoraux est compensée en l'absence de développement de LRRC15 + CAF (Extended Data Fig. 1g, h). Aucun changement significatif dans l'abondance relative du cluster proliférant 4 n'a été observé, mais les cellules proliférantes des souris Dptki/kiTgfbr2fl/fl ont obtenu un score faible pour la signature Tgfb CAF PDAC GEMM. En revanche, les cellules d'animaux Dptwt / wtTgfbr2fl / fl ont obtenu un score élevé pour cette signature, ce qui est conforme à notre découverte selon laquelle la formation de LRRC15 + CAF à partir de fibroblastes universels DPT + dépend de TGFβR2 (Extended Data Fig. 1i).

Nous avons ensuite demandé si la même activation de la voie était nécessaire pour le développement du CAF LRRC15+ dans le pancréas, un site tissulaire avec une abondance similaire de fibroblastes universels DPT+ à l'état d'équilibre10. Des cellules tumorales KPR ont été implantées orthotopiquement dans le pancréas de souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl ou Dptki/kiTgfbr2fl/fl, et les tumeurs ont été analysées 15 jours plus tard (Fig. 1a, en bas). Comme pour les tumeurs KPR sous-cutanées, le développement de LRRC15 + PDPN + CAF dans les tumeurs pancréatiques orthotopiques était significativement altéré chez les souris Dptki / kiTgfbr2fl / fl par rapport aux souris témoins Dptwt / wtTgfbr2fl / fl, alors que le nombre total de PDPN + CD31– fibroblastes est resté inchangé (Fig. .1h–j).

Ces données fournissent une preuve directe in vivo que la signalisation TGFβ est nécessaire pour la différenciation des fibroblastes universels DPT+ en myofibroblastes LRRC15+. Le développement du CAF LRRC15 + émoussé a entraîné une accumulation de fibroblastes universels DPT + et de CAF indépendants du TGFβR2 pour maintenir le compartiment CAF en leur absence. Il est important de noter que cette relation de lignée et cette dépendance de signalisation étaient nécessaires dans plusieurs sites tissulaires, ce qui confirme la nature universelle des fibroblastes DPT+.

Ensuite, nous avons cherché à comprendre si l'axe entre les fibroblastes universels et les myofibroblastes LRRC15+ était représentatif du compartiment des fibroblastes dans les cancers humains. Des études antérieures1 s'appuyaient sur la déconvolution des données de séquençage d'ARN en vrac d'échantillons de tumeurs entières de l'Atlas du génome du cancer (TCGA) pour déduire l'abondance d'un sous-ensemble spécifique de CAF dans toutes les indications. Pour nous concentrer spécifiquement sur l'hétérogénéité dans le compartiment des fibroblastes entre les types de cancers humains, nous avons trié les cellules stromales CD45 – CD44 + CD90 + de 159 échantillons de patients dans 13 indications (Fig. 1k et tableau supplémentaire 3) et généré des profils d'expression d'ARN-seq en vrac. Le filtrage des échantillons de haute pureté sur la base de l'analyse en composantes principales (ACP) et du regroupement hiérarchique a permis d'avoir une vue impartiale sur les programmes d'expression de la CAF humaine et leur prévalence pan-cancer (Extended Data Fig. 2a). Nous n'avons pas observé de séparation claire des indications de cancer dans l'espace PCA, ce qui suggère que les signatures de cellules stromales pancancer étaient à l'origine des deux premiers composants principaux (PC) (Fig. 1l). Les gènes avec les poids positifs les plus forts pour PC1 comprenaient des gènes marqueurs d'expression LRRC15 + CAF connus tels que COL10A1, COL11A1, MMP11 et LRRC15 (réf. 1). À l'inverse, les marqueurs associés aux fibroblastes universels précédemment décrits, tels que CD34 et PI16, avaient les poids négatifs les plus forts pour PC1 (réf. 10) (Fig. 1m). De manière constante, les échantillons obtenus à partir de tissus adjacents normaux présentaient principalement des valeurs PC1 négatives (données étendues Fig. 2b). Parmi les indications analysées, les échantillons de cancer du pancréas et de cancer de la vessie présentaient les valeurs PC1 les plus élevées, ce qui indique un fort enrichissement en CAF LRRC15+ (Fig. 1n). La tendance des niveaux élevés de LRRC15+ CAF dans le cancer du pancréas a été confirmée dans un ensemble de données indépendant (Extended Data Fig. 2c). L'analyse d'enrichissement des voies a révélé que les échantillons présentant des niveaux élevés d'expression de LRRC15 présentaient une activation accrue de la voie TGFβ, suggérant ainsi fortement que le programme d'expression LRRC15 + CAF chez l'homme, comme démontré génétiquement dans notre modèle de souris, est également piloté par la signalisation TGFβ (Fig. 1o). Des niveaux d'expression élevés des marqueurs TGFβ CAF étaient significativement associés à une survie plus faible dans tous les échantillons de toutes les indications du TCGA et dans certains types de tumeurs, y compris le cancer de la vessie et le cancer du pancréas (Fig. 1p et Extended Data Fig. 2d). Ces données humaines révèlent un axe central d'hétérogénéité des CAF dans les cancers humains définis par les fibroblastes universels et les myofibroblastes LRRC15+, avec une signalisation TGFβ enrichie dans les indications dans lesquelles les CAF LRRC15+ sont abondants.

Avec les résultats de notre système génétique de souris, ces résultats suggèrent que la signalisation TGFβ agit comme un rhéostat pour dicter le point de consigne des fibroblastes tumoraux entre les fibroblastes universels et les myofibroblastes LRRC15 + et peut servir de prédicteur potentiel des résultats pour le patient.

Pour étudier l'impact des CAF LRRC15+ sur la croissance tumorale et l'immunité anti-tumorale, un modèle génétique de souris a été généré dans lequel une cassette récepteur de la toxine diphtérique (DTR)-GFP a été frappée dans l'exon 2, en aval du codon d'initiation de Lrrc15 (Lrrc15DTRGFP knock- Chez la souris). Ce modèle a permis l'épuisement contrôlé des cellules exprimant LRRC15 après l'administration de toxine diphtérique (DT) (Fig. 2a, en haut). Pour s'assurer que cette approche fournirait une ablation sélective de cette sous-population de CAF, nous avons évalué l'expression de LRRC15 chez la souris. Dans les tumeurs KPR, l'expression de LRRC15 était limitée aux fibroblastes PDPN + et largement absente dans les autres compartiments (données étendues Fig. 3a). En dehors des tumeurs, l'hybridation in situ et l'analyse en masse de l'ARN-seq12 ont montré que l'expression de Lrrc15 était faible à absente dans plusieurs tissus (données étendues Fig. 3b, c). Des résultats similaires ont été rapportés dans des tumeurs humaines et des tissus périphériques13.

a, Schéma de l'approche génétique (en haut) et expérimentale (en bas) pour les souris Lrrc15DTRGFP. b – e, les données proviennent de tumeurs KPR sous-cutanées 8 jours après le traitement DT chez les souris DTR– et DTR +. b, Parcelles représentatives de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules PDPN + LRRC15 +. Les cellules ont été fermées sur des cellules CD24 – CD45 – (à gauche) ou des cellules PDPN + CD31 – (à droite). c,d, Quantification du nombre total de cellules PDPN+LRRC15+ (c) et PDPN+CD31– (d) normalisé par le poids de la tumeur (n = 12 ou 14 souris). e, Images d'immunofluorescence représentatives de LRRC15 et DAPI. Barre d'échelle, 250 µm. f, Courbes de croissance tumorale des souris DTR– et DTR+ traitées avec DT (n = 9 ou 11 souris par groupe). Gauche : volume moyen de la tumeur chez tous les animaux (*P = 0,015, ***P = 0,0006, ****P < 0,0001). Au milieu et à droite : courbes de croissance individuelles des animaux par génotype. L'axe des x représente les jours après le traitement DT. La ligne rouge en pointillés représente l'ajustement de référence moyen pour le groupe de contrôle (Ctrl). Les données en c et d sont regroupées à partir de quatre expériences indépendantes. Les données en e et f sont représentatives de deux ou trois expériences indépendantes. Les données en c, d et f sont la moyenne ± sd Les statistiques ont été calculées à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié (c et d) ou d'une analyse de variance bidirectionnelle ordinaire (f).

Données source

Comme les stratégies précédentes d'épuisement des CAF utilisaient des marqueurs tels que l'actine musculaire lisse α (αSMA, codée par Acta2) et la protéine d'activation des fibroblastes (FAP, codée par Fap) 14, 15, nous avons comparé les niveaux d'expression de Fap et Acta2 à Lrrc15. Dans les tumeurs KPR, l'expression de Lrrc15 était limitée aux fibroblastes, tandis que l'expression d'Acta2 et de Fap a été observée à la fois dans les fibroblastes et les péricytes (Extended Data Fig. 3d). Au-delà de la tumeur, l'expression de Fap et d'Acta2 a été observée dans les cellules stromales de plusieurs tissus, alors que Lrrc15 était absent (Extended Data Fig. 3e). Dans les ganglions lymphatiques drainant la peau de la souris (LN), Acta2 était fortement exprimé par les péricytes, et l'expression de Fap et d'Acta2 se chevauchait de manière proéminente avec les cellules réticulaires fibroblastiques Ccl19 +. En revanche, Lrrc15 était indétectable dans les cellules réticulaires fibroblastiques LN ou les péricytes16 (Extended Data Fig. 3f). Collectivement, ces données démontrent que LRRC15 est un marqueur authentique des CAF pilotés par le TGFβ qui ne se chevauchent pas avec d'autres cellules à l'intérieur et au-delà des tumeurs.

Compte tenu de la spécificité de l'expression de Lrrc15, nous avons évalué l'impact de l'épuisement sélectif des CAF LRRC15+ sur la croissance tumorale. Des tumeurs KPR ont été implantées par voie sous-cutanée dans des souris Lrrc15DTRGFPwt/wt (DTR–) ou Lrrc15DTRGFPwt/ki (DTR+), et un traitement DT a été initié dans les deux groupes de souris lorsque les tumeurs ont atteint un volume moyen de 100 à 200 mm3 (environ 10 jours après l'implantation) (Fig. 2a, en bas). Huit jours plus tard, les tumeurs ont été collectées et évaluées pour la présence de CAF LRRC15+. Les tumeurs des souris DTR– traitées au DT avaient une population prédominante de CAF LRRC15 +, alors que le traitement au DT dans les tumeurs DTR + entraînait une perte d'environ 98% du total des cellules LRRC15 + (Fig. 2b, c). Il est important de noter que la perte de CAF LRRC15 + chez les souris DTR + était spécifique au traitement DT et non le résultat d'un développement insuffisant de ces cellules en l'absence de DT (Extended Data Fig. 4a, b). Le nombre total de fibroblastes PDPN + a également été significativement réduit d'environ 70% chez les souris DTR + traitées au DT (Fig. 2d). L'imagerie par immunofluorescence a confirmé ces résultats, montrant une absence de coloration LRRC15 dans les tumeurs DTR + (Fig. 2e). L'administration continue de DT a entraîné une déplétion significative de LRRC15 + CAF et une diminution du compartiment des fibroblastes PDPN + au-delà du jour 8 et n'a provoqué aucune modification significative du poids corporel dans les deux groupes de souris (données étendues Fig. 4c, d). En conséquence, la croissance tumorale a été considérablement ralentie après un épuisement soutenu des CAF LRRC15 + chez les souris DTR + par rapport aux souris témoins DTR– (Fig. 2f). Ensemble, ces données montrent que l'ablation sélective du sous-type LRRC15+ des CAF dans les tumeurs entraîne une diminution significative du contenu total en CAF et une réduction marquée et persistante de la charge tumorale.

L'impact significatif de l'ablation LRRC15 + CAF sur le compartiment des fibroblastes nous a amenés à étudier la composition de l'environnement CAF restant en leur absence. Le scRNA-seq des cellules stromales CD24–CD45– des tumeurs chez les souris DTR– et DTR+ a été réalisé à 4 moments différents, y compris 10 jours après l'implantation de la tumeur et immédiatement avant le début du traitement DT (IOT) (jour 0) et les jours 7, 14 et 21 après IOT (Fig. 3a et Extended Data Fig. 5a, en haut). Le traitement DT a été initié chez toutes les souris du jour 0 au jour 14, puis arrêté pendant la dernière semaine de l'étude jusqu'au jour 21 (Fig. 3a). De plus, des cellules stromales EPCAM – CD45 – de tissus cutanés naïfs et non porteurs de tumeurs ont été caractérisées pour établir un profil de base avant l'implantation de la tumeur (Fig. 3a et Extended Data Fig. 5a, en bas).

a, schéma expérimental (n = 5 souris par point de temps et groupe). b, graphique UMAP de 37 383 fibroblastes simples colorés par l'appartenance au cluster (à gauche) ou colorés par le tissu d'origine (au milieu). Expression moyenne relative des gènes marqueurs indiqués dans les grappes de l'UMAP gauche (à droite). c, UMAP comme dans b, coloré par l'expression de Pi16 et Lrrc15 et divisé par point temporel et condition. d, Dot plot visualisant le pourcentage de fibroblastes positifs (taille du point) et l'expression moyenne relative (couleur) pour Lrrc15 et Pi16 à chaque instant et condition dans les échantillons porteurs de tumeur. e, Fraction de cellules dans le groupe 0 de chaque groupe de traitement (n = 5 souris par groupe) aux quatre points dans le temps dans des échantillons porteurs de tumeur. f, scores d'enrichissement de la voie PROGENy (couleur) pour les cellules regroupées pour chacun des points temporels et conditions indiqués (rangée du bas). Les données en e sont la moyenne + sem, et les statistiques ont été calculées à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié.

Données source

Après contrôle de la qualité, 54 240 cellules stromales uniques ont été analysées à tous les moments et groupes de traitement. La réduction de la dimensionnalité et le regroupement ont révélé des péricytes (Rgs5 +), des cellules endothéliales (Pecam1 +, également appelées Cd31 +) et des fibroblastes (Lum +) comme les trois principales populations de cellules stromales (Données étendues Fig. 5b, à gauche et en bas, et Tableau supplémentaire 4). Tous les groupes ont été peuplés de cellules provenant de plusieurs animaux et les analyses ultérieures se sont concentrées sur les fibroblastes (données étendues Fig. 5b, à droite et tableau supplémentaire 5). Les fibroblastes provenant de tissus cutanés naïfs ont formé deux groupes distincts (groupes 3 et 4) avec peu ou pas de mélange de cellules de souris porteuses de tumeurs (Fig. 3b). Dans les tissus porteurs de tumeurs, les fibroblastes pourraient être attribués à quatre phénotypes d'expression transcriptionnelle : un cluster Lrrc15 (cluster 0) qui exprime également des marqueurs de myofibroblastes tels que Tagln et Spp1 ; un cluster de CAF en prolifération (cluster 5) ; un groupe de CAF exprimant Cxcl14 (groupe 2); et un groupe de CAF Pi16high (groupe 1) qui partageaient des modèles d'expression avec des fibroblastes universels10 (Fig. 3b).

La dynamique des fibroblastes chez les souris DTR- et DTR + traitées au DT a ensuite été surveillée, et l'expression de Pi16 et Lrrc15 à chaque instant a été comparée (Fig. 3c). Dans la peau naïve et non porteuse de tumeur, l'expression de Lrrc15 était absente et toutes les cellules étaient uniformément Pi16+. Ce résultat a indiqué un phénotype de fibroblaste universel similaire à celui des fibroblastes de tissu pancréatique normal1,10. Dans le tissu tumoral, au jour 0, des cellules Pi16+ et des cellules Lrrc15+ ont été détectées. Chez les animaux DTR–, les CAF LRRC15+ sont apparus comme la population dominante de CAF tout au long de l'évolution, commençant au jour 7 et persistant jusqu'au jour 21 (Fig. 3c, d). Inversement, chez les animaux DTR +, les cellules Lrrc15 + étaient absentes au cours des 2 premières semaines de traitement DT, et une augmentation relative concomitante des cellules Pi16 +, dont un sous-ensemble exprimait également Cxcl12, a été observée (Fig. 3c, d et Données étendues Fig. 5c ). Au jour 21, 1 semaine après l'arrêt du traitement DT, les cellules Lrrc15 + ont réapparu (Fig. 3c, d). Ce même schéma de cinétique de Lrrc15 s'est reflété au niveau du cluster, dans lequel la fréquence des cellules du cluster LRRC15 + CAF 0 a augmenté et s'est maintenue chez les animaux DTR–. En revanche, les animaux DTR + étaient appauvris en CAF du groupe 0 avant la réémergence après l'élimination du DT (Fig. 3e). Les fréquences relatives des groupes 1, 2 et 5 associés aux tumeurs ont également augmenté chez les animaux DTR + (données étendues Fig. 5d). L'expression partiellement conservée de Pi16 par les CAF des groupes 1, 2 et 5 suggère qu'ils sont dans un état plus similaire aux fibroblastes de tissus normaux. À l'appui de cette observation, les groupes 1 et 2 ont obtenu des scores plus élevés pour une signature des fibroblastes cutanés normaux des groupes 3 et 4 que pour les groupes 0 et 5 (données étendues Fig. 5e).

L'analyse de l'activité de la voie PROGENy17 a révélé une activité TGFβ élevée dans les échantillons dans lesquels des CAF LRRC15+ étaient présents. En revanche, les échantillons dans lesquels les CAF LRRC15 + étaient épuisés étaient les plus similaires aux échantillons de fibroblastes de peau naïve et enrichis pour les voies de signalisation JAK – STAT, NF-κB et TNF (Fig. 3f). Cela s'explique en grande partie par les changements susmentionnés dans l'abondance des clusters, dans lesquels les clusters 1 et 2 partageaient les voies de signalisation JAK – STAT, NF-κB et TNF avec des fibroblastes de tissus normaux (clusters 3 et 4) par rapport au cluster 0, qui avait l'activité TGFβ la plus élevée. (Données étendues Fig. 5f). Ensemble, ces données indiquent que l'épuisement des CAF LRRC15 + réduit non seulement la teneur globale en fibroblastes dans les tumeurs KPR, mais recalibre également le point de consigne des CAF restants vers un état de type fibroblaste plus universel.

Des études récentes ont identifié une association clinique entre une expression élevée d'une signature LRRC15+ CAF et l'absence de réponse au traitement anti-PDL1 dans plusieurs types de cancer1,2. Cependant, il reste à déterminer si les CAF LRRC15+ sont la cause directe de cette association. Nous avons proposé que l'immunité des lymphocytes T et la réactivité de l'ICB seraient affectées en l'absence de CAF LRRC15+ et nous l'avons testé dans notre modèle préclinique. Tout d'abord, nous avons déterminé si l'amélioration du contrôle tumoral observée après l'ablation du CAF LRRC15+ dépend des lymphocytes T CD8+. À cette fin, des souris DTR– et DTR+ portant des tumeurs KPR sous-cutanées et traitées avec DT ont également reçu un anticorps de contrôle d'isotype ou déplétant CD8. La croissance tumorale a été surveillée au cours du traitement (Fig. 4a). Les souris chez lesquelles les CAF LRRC15 + étaient épuisés présentaient une charge tumorale significativement réduite par rapport aux souris avec suffisamment de CAF LRRC15 + (Fig. 4b et Extended Data Fig. 6a). L'épuisement des lymphocytes T CD8 a inversé cet effet, ce qui indique que les lymphocytes T CD8 + jouent un rôle dans la réduction de la charge tumorale en l'absence de CAF LRRC15 + (Fig. 4b et Extended Data Fig. 6a).

a,b, Les données proviennent de souris DTR– et DTR+ portant des tumeurs KPR sous-cutanées traitées avec DT et un anticorps déplétant CD8. a, schéma expérimental. b, Courbes de croissance tumorale moyenne (n = 10 souris par groupe ; *** P = 0,0002, **** P < 0,0001). c – e, Analyse tumorale KPR sous-cutanée au jour 12 après le traitement DT chez les souris DTR– et DTR +. c, Quantification des cellules T CD8+ normalisées par le poids de la tumeur (n = 10 souris). d, Quantification de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) de TIM3, LAG3 et CD39 sur les lymphocytes T CD8+PD1+ (n = 5 souris). e, Quantification de la fréquence des lymphocytes T CD8+ TNF+ et IFNγ+ (n = 10 souris). f, Quantification de la fréquence de TNF+ et IFNγ+ des lymphocytes T CD8+ activés anti-CD3 et anti-CD28 après 72h de culture seuls ou avec des CAF triés (L15, LRRC15 ; n = 4 échantillons). g–j, Les données proviennent de souris DTR– et DTR+ porteuses de tumeurs KPR sous-cutanées traitées avec DT et un anticorps anti-PDL1. g, schéma expérimental. h, courbes de croissance tumorale moyenne (n = 9 ou 10 souris par groupe ; **** P < 0,0001). i,j, Analyse tumorale KPR sous-cutanée 12 jours après le traitement montrant la quantification de la fréquence des cellules T granzyme B+ CD8+ (n = 10 souris) (i) et TNF+IFNγ+cellules T granzyme B+ CD8+ (n = 10 souris) (j) . k–m, Les données proviennent de souris DTR– et DTR+ portant des tumeurs KPR pancréatiques orthotopiques traitées avec DT et un anticorps anti-PDL1 k, Schéma expérimental. l, Courbes de croissance tumorale moyenne (n = 7 souris par groupe). L'axe des x représente les jours après l'implantation. m, poids de la tumeur au jour 24 après l'implantation (n = 5 souris). Les données en b–f, h–j, l et m sont la moyenne ± sd Les données en b, h, d et f sont représentatives de deux expériences indépendantes et l et m sont représentatifs d'une expérience indépendante. Les données en c, e, I et j sont regroupées à partir de deux expériences indépendantes. Les statistiques ont été calculées à l'aide d'un test d'analyse de variance à une voie ordinaire (b, f, h – j, l, m) ou d'un test t de Student bilatéral non apparié (c, d, e). Les valeurs de signification marquent le groupe d'isotype DTR++ en b et le groupe DTR++ anti-PDL1 en h par rapport aux trois autres groupes.

Données source

Pour comprendre les effets pharmacodynamiques de l'épuisement des CAF LRRC15+ sur la fonction des lymphocytes T, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour caractériser le compartiment intratumoral des lymphocytes T CD8+ 12 jours après l'épuisement des CAF. Aucune différence dans le nombre total de cellules T CD8 + intratumorales entre les tumeurs LRRC15 + suffisantes en CAF et déficientes en CAF n'a été observée (Fig. 4c). Cependant, en l'absence de CAF LRRC15 +, les cellules T PD1 + CD8 + présentaient une expression significativement réduite des marqueurs de surface des molécules associées à l'épuisement et au dysfonctionnement des cellules T18,19, notamment TIM3, LAG3 et CD39 (Fig. 4d). De plus, nous avons observé une amélioration de la fonction des lymphocytes T CD8 +, comme le montre l'expression accrue de TNF et d'IFNγ (Fig. 4e).

L'analyse par immunofluorescence des tumeurs KPR a révélé une proportion significative de lymphocytes T CD8 + infiltrant la tumeur à proximité des CAF LRRC15 +, ce qui suggère que des interactions directes de cellule à cellule se produisaient (données étendues Fig. 6b). Cela nous a amenés à nous demander si les CAF LRRC15 + peuvent influencer directement le potentiel des lymphocytes T effecteurs. Les CAF LRRC15+ et LRRC15– des tumeurs DTR– ou les CAF déplétés en PDPN+ LRRC15 des tumeurs DTR+ ont été triés 12 jours après le traitement DT. Ceux-ci ont ensuite été co-cultivés individuellement avec des cellules T CD8 + spléniques en présence d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (Extended Data Fig. 6c, d). Trois jours plus tard, les lymphocytes T CD8+ ont été restimulés et évalués pour l'expression des protéines TNF et IFNγ. Par rapport aux lymphocytes T CD8 + seuls, l'expression du TNF et de l'IFNγ était significativement réduite en présence de CAF LRRC15 +, tandis que la fonction des lymphocytes T était inchangée en présence de CAF LRRC15– ou de CAF appauvris en LRRC15 normalisés (Fig. 4f). Ces résultats démontrent un rôle des CAF LRRC15+ dans la répression de la fonction intratumorale des lymphocytes T CD8+ et montrent que les CAF LRRC15+ peuvent limiter directement le potentiel effecteur des lymphocytes T CD8+.

Des travaux antérieurs ont montré que la déplétion des myofibroblastes FAP+ dans des modèles de cancer peut améliorer la réactivité anti-PDL120. Nous voulions tester si des effets similaires sont observés après l'ablation du CAF LRRC15+. Des souris DTR– et DTR + portant des tumeurs KPR sous-cutanées et traitées avec DT ont reçu un anticorps anti-PDL1 ou un anticorps de contrôle d'isotype, et la croissance tumorale a été évaluée (Fig. 4g). Les souris LRRC15 + CAF suffisantes ont montré une certaine sensibilité au traitement anti-PDL1, comme en témoigne une réduction partielle de la charge tumorale. À l'inverse, la réactivité au traitement anti-PDL1 a été significativement potentialisée chez les souris LRRC15 + CAF appauvries, comme en témoigne la réduction plus substantielle de la charge tumorale. (Fig. 4h et données étendues Fig. 6e). Ce paramètre de combinaison a non seulement amélioré le contrôle de la tumeur, mais a également conduit à un bénéfice de survie significatif, mesuré par le temps jusqu'à la progression des tumeurs (données étendues Fig. 6f). L'analyse par cytométrie en flux du compartiment des lymphocytes T CD8 + 12 jours après le traitement anti-PDL1 avec déplétion LRRC15 + CAF a révélé une augmentation de leur potentiel cytolytique, mesuré par l'expression du granzyme B. La fréquence des lymphocytes T polyfonctionnels a également augmenté, comme en témoigne le nombre de lymphocytes T TNF + IFNγ + granzyme B + CD8 + (Fig. 4i, j).

Nous avons ensuite demandé si l'absence de CAF LRRC15+ améliorait la réactivité au traitement anti-PDL1 dans les tumeurs KPR développées dans le pancréas. Des cellules tumorales KPR ont été implantées orthotopiquement dans le pancréas de souris DTR– ou DTR+. Au jour 7 après l'implantation, un traitement DT en association avec un anticorps anti-PDL1 ou un contrôle d'isotype a été initié, et la charge tumorale a été mesurée par imagerie ultrasonore (Fig. 4k et données étendues Fig. 7a). Semblable aux tumeurs sous-cutanées, l'ablation des CAF LRRC15+ dans les tumeurs pancréatiques orthotopiques a considérablement amélioré le contrôle tumoral et s'est synergisée avec l'anti-PDL1 pour réduire davantage la charge tumorale (Fig. 4l et Données étendues Fig. 7b). Les tumeurs collectées au jour 24 sur des souris DTR + traitées avec l'anti-PDL1 présentaient des poids tumoraux significativement inférieurs à ceux des souris témoins, ce qui reflétait la cinétique du volume tumoral observée pendant le traitement (Fig. 4m). De plus, les tumeurs pancréatiques DTR +, qu'elles soient traitées avec un anti-PDL1 ou un contrôle isotypique, ont montré une ablation presque complète des CAF LRRC15 + et une réduction significative du compartiment total des fibroblastes PDPN + (Extended Data Fig. 7c-e). Ensemble, ces résultats montrent que l'épuisement thérapeutique des CAF LRRC15 + du microenvironnement de la tumeur pancréatique conduit à une réactivité nettement améliorée au traitement anti-PDL1 ICB.

Dans cette étude, nous avons fourni des preuves génétiques directes que la signalisation TGFβ dans les fibroblastes universels DPT + favorise la formation de myofibroblastes LRRC15 + au cours de la tumorigenèse, constituant un axe central des fibroblastes dans plusieurs cancers humains. L'épuisement sélectif des CAF LRRC15+ a nettement réduit la teneur totale en fibroblastes et ramené ce compartiment stromal à un état universel de type fibroblaste. À son tour, cette fonction effectrice intratumorale des lymphocytes T CD8 + et la réactivité anti-PDL1 potentialisées.

L'utilité de LRRC15 en tant que marqueur hautement restreint pour ce sous-ensemble de myofibroblastes nous a permis d'étudier directement leur rôle dans la formation du TME sans perturber les fibroblastes dans d'autres tissus, tels que les LN, où l'architecture tissulaire et l'amorçage et la fonction des lymphocytes T sont façonnés par le fibroblastique local. réseau16,21. Les analyses des tumeurs appauvries en CAF LRRC15+ ont révélé que l'activité universelle de type fibroblaste était enrichie mais sans ablation soutenue, les myofibroblastes LRRC15+ peuvent reconstituer et rétablir leur pied dans le compartiment CAF. Ces données mettent en évidence la relation « push and pull » que les CAF LRRC15+ entretiennent avec les fibroblastes universels pour établir un point de consigne des fibroblastes tumoraux qui supprime finalement l'immunité anti-tumorale des lymphocytes T et l'efficacité de la thérapie ICB. Sur le plan immunologique, une enquête plus approfondie est justifiée pour comprendre la nature de la relation entre les lymphocytes T CD8 + et les CAF LRRC15 + qui conduit à leur suppression fonctionnelle. De plus, il sera important de comprendre si les CAF LRRC15+ dictent la réactivité de l'ICB de manière similaire dans différentes indications et phénotypes immunitaires tumoraux.

Sur le plan thérapeutique, nos résultats soulèvent la question de la stratégie optimale pour moduler l'activité des CAF LRRC15+. L'utilisation d'inhibiteurs de TGFβ, qui sont actuellement évalués dans plusieurs essais cliniques22, est une option thérapeutique intéressante pour altérer la formation de LRRC15+ CAF. Cependant, la suppression de la signalisation TGFβ dans les précurseurs DPT + a permis à un mécanisme compensatoire de maintenir le nombre total de fibroblastes. À l'inverse, l'ablation LRRC15 + CAF a nettement réduit la cellularité des fibroblastes dans le TME. Si l'environnement optimal pour une réponse immunitaire anti-tumorale efficace nécessite un compartiment CAF à la fois plus petit et dépourvu de CAF LRRC15+, nos données suggèrent fortement que l'épuisement des CAF LRRC15+ eux-mêmes peut être une stratégie thérapeutique plus intéressante pour générer des réponses robustes et durables au cancer immunothérapie. De plus, la présence de myofibroblastes LRRC15+ dans d'autres maladies non néoplasiques, telles que la fibrose pulmonaire idiopathique et la colite ulcéreuse10, suggère qu'une telle approche thérapeutique peut être élargie pour apporter un bénéfice au patient dans d'autres domaines pathologiques.

Les souris DptIresCreERT210 et Lrrc15DTRGFP ont été conçues, générées et élevées chez Genentech. Des souris Tgfbr2fl/fl (012603) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. Des souris appariées selon l'âge et le sexe (âgées de 6 à 12 semaines) ont été utilisées pour toutes les études. Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes en suivant les directives des National Institutes of Health des États-Unis. Les tailles d'échantillon pour chaque étude sont décrites dans les légendes des figures. Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de Genentech.

La recombinaison homologue et la technologie des cellules souches embryonnaires de souris (ES)23,24,25 ont été utilisées pour générer une souche de souris génétiquement modifiée avec Lrrc15 DTR – GFP knock-in. Un vecteur de ciblage génique a été construit avec un bras d'homologie 5 'de 1 704 pb correspondant au chromosome 16 GRCm38 / mm10 : 30 274 520–30 276 223 et un bras d'homologie 3 'de 1 994 pb correspondant au chromosome 16 : 30 270 786–30 272 779. La suppression de l'exon 2 après ATG correspond au chromosome 16 : 30 272 780–30 274 516. DTR-EGFP-SV40-FRT-PGK-neo-FRT a été inséré immédiatement après l'ATG de l'exon 2. Le vecteur final a été confirmé par séquençage d'ADN, linéarisé et utilisé pour cibler les cellules ES C2 (C57BL/6N) en utilisant des méthodes standard (G418+ et ganciclovir– sélection)26 Des cellules C57BL/6N C2 ES27 ont été électroporées avec 20 µg d'ADN de vecteur de ciblage linéarisé et cultivées sous sélection médicamenteuse essentiellement comme décrit précédemment28. Les clones positifs ont été identifiés par PCR à longue portée suivie d'une confirmation de séquence. Les cellules ES correctement ciblées ont été soumises à un caryotypage. Les clones de cellules ES ciblées sur le gène euploïde ont été traités avec Adeno-FLP pour éliminer la néomycine PGK, et les clones de cellules ES ont été testés pour identifier les clones sans copies de la cassette de néomycine PGK, et la séquence correcte de l'allèle ciblé a été vérifiée. La présence du chromosome Y a été vérifiée avant microinjection dans des embryons albinos Bl/6N. La transmission germinale a été obtenue après croisement des chimères résultantes avec des femelles C57BL/6N. L'ADN génomique des chiots a été criblé par PCR à longue portée pour vérifier la structure ciblée par le gène souhaitée avant l'expansion de la colonie de souris. Pour le génotypage, les amorces suivantes ont été utilisées : 5′-AGGCGAGGCGATTG-3′, 5′-CGATGAGGGCTGAAATGT-3′ et 5′-TGGTCCGTGGATACAGT-3′ amplifiés de 408 pb de type sauvage et de 313 pb de knock-in. Le cycle de PCR suivant a été utilisé : 94 °C pendant 4 min, (94 °C pendant 1 min, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min) pendant 30 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; 4 °C à l'infini.

La lignée cellulaire d'adénocarcinome pancréatique de souris KPR a été générée par le groupe Junttila de Genentech à partir de KPR PDAC GEMM (KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt;p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre)11. Les cellules KPR ont été cultivées dans du RPMI avec 10% de FBS (Hyclone) plus 2 mmol l–1 l-glutamine. Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour la contamination par Mycoplasma par PCR quantitative (Lonza Mycoalert et Stratagene Mycosensor). Pour toutes les tumeurs injectées, les cellules ont été utilisées dans les trois premiers passages.

Pour les tumeurs KPR sous-cutanées, les cellules KPR ont été trypsinisées, filtrées, comptées et remises en suspension dans un mélange 1: 1 de solution saline tamponnée de Hanks et de Matrigel sans rouge de phénol (Corning) à une concentration de 1 × 106 cellules ml–1. Pour tous les génotypes de souris utilisés, des souris âgées de 6 à 12 semaines appariées selon l'âge et le sexe ont été inoculées par voie sous-cutanée dans le flanc unilatéral droit avec 1 × 105 cellules tumorales KPR. Les poils de la peau du flanc ont été rasés avant l'implantation. Les volumes tumoraux ont été mesurés et calculés 2 à 3 fois par semaine à l'aide de la formule d'ellipsoïde modifiée suivante : ½ × (longueur × largeur2). Les tumeurs > 1 000 mm3 ont été considérées comme ayant progressé et les animaux ont été retirés de l'étude. De même, les animaux pour lesquels des tumeurs ulcérées supérieures à 5 mm ont été retirés de l'étude. Pour les études sur les tumeurs sous-cutanées chez les souris Lrrc15DTRGFP, lorsque les tumeurs ont atteint un volume de 100 à 200 mm3 (environ 10 jours après l'inoculation), les animaux ont été répartis en groupes de traitement sur la base du volume de la tumeur et le traitement a été lancé.

Pour les tumeurs KPR pancréatiques orthotopiques, l'injection de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris a été réalisée comme décrit précédemment29. Les cellules KPR ont été remises en suspension dans un mélange 1: 1 de solution saline tamponnée de Hanks et de Matrigel sans rouge de phénol (Corning) à une concentration de 2 × 105 ou 2 × 106 cellules ml–1. Des souris DptCreERT2Tgfbr2fl/fl ou Lrrc15DTR ont été anesthésiées à l'aide d'une anesthésie par inhalation, placées sur un coussin chauffant et ont reçu un collyre en gel. Le flanc gauche ou la région abdominale a été rasé et stérilisé à l'aide de ChloraPrep (BD) avant de pratiquer une incision d'environ 1 cm avec des microciseaux stériles en dedans de la silhouette splénique. La couche musculaire sous-jacente a été incisée et des pinces à nez émoussé ont été utilisées pour extérioriser le pancréas et la rate. Une aiguille de calibre 31 préparée contenant la solution cellulaire a été insérée dans la queue du pancréas et 50 µl de solution contenant 1 × 105 cellules ont été lentement injectés. La plaie a été refermée à l'aide de sutures résorbables et de clips de plaie et les souris ont pu récupérer. Tous les animaux ont reçu l'analgésique à libération lente buprénorphine SR LAB à 0,5 mg kg–1. Les souris ont été surveillées tous les jours après l'intervention chirurgicale pour détecter des signes d'infection ou de détresse. Pour les études de tumeurs orthotopiques chez les souris Lrrc15DTRGFP, 7 jours après l'implantation, les animaux ont été répartis en groupes de traitement sur la base du volume de la tumeur et le traitement a été lancé.

Les souris ont été collectées aux moments indiqués après le traitement pour analyse ou utilisées pour des études de croissance tumorale. La taille des échantillons dans les études sur les souris était basée sur le nombre de souris systématiquement nécessaires pour établir une signification statistique basée sur la variabilité au sein des groupes d'étude. Les groupes de traitement ont été aveuglés lorsque cela était possible. Toutes les études animales présentées ici ont été approuvées par le Genentech Institutional Animal Care and Use Committee.

Pour les études sur les tumeurs pancréatiques orthotopiques chez les souris Lrrc15DTRGFP, les volumes tumoraux ont été mesurés par imagerie ultrasonore. Les souris ont été anesthésiées avec du sévoflurane à 4 % (Zoetis) dans une boîte d'induction chaude et positionnées sur le côté droit sous un flux continu de sévoflurane à 2, 5-3 % pendant l'imagerie. Après l'épilation, un gel de couplage à ultrasons a été placé sur la peau et des images anatomiques en mode B ont été acquises sur vevo2100 (Fujifilm VisualSonics-) dans des plans transversaux et longitudinaux, capturant les sections transversales maximales de la tumeur (sonde MS-550D ; fréquence centrale de 40 MHz, résolution axiale de 40 µm, résolution latérale de 90 µm et profondeur de champ de 12 mm). Le volume de la tumeur pancréatique par souris a été analysé à l'aide de Vevo LAB v.5.5.1 avec la formule suivante pour un ellipsoïde : volume (mm3) = π/6 × longueur × largeur × profondeur.

Pour l'expression de Cre induite par TAM, les souris ont reçu une injection de 2 mg de TAM (Sigma, T5648) dilué dans de l'huile de tournesol (Sigma, 88921) pendant cinq jours consécutifs par voie intrapéritonéale ou ont été nourries avec de la nourriture contenant du TAM (Envigo, TD.130859). Pour l'ablation du CAF LRRC15, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 25 ng g–1 de DT (Enzo Life Sciences, BML-G135) deux fois par semaine. Pour les études de déplétion en CD8, les souris ont été traitées soit avec un anticorps de contrôle d'isotype IgG2b de rat, soit avec des anticorps de rat anti-CD8 IgG2b déplétants (BioXcell, BE0061) à une dose de 10 mg kg-1 administrée par voie intrapéritonéale trois fois par semaine. Pour les études anti-PDL1, les souris ont été traitées avec des anticorps de contrôle d'isotype ou des anticorps anti-PDL1 (6E11) (en interne). La première dose a été administrée à 10 mg kg–1 suivie de 5 mg kg–1 ensuite administrée par voie intrapéritonéale deux fois par semaine.

Les tumeurs ont été recueillies, pesées et hachées en petits morceaux. Pour isoler la peau du flanc naïf, les cheveux ont été rasés, le tissu adipeux a été retiré et le tissu cutané a été haché. Tous les tissus ont ensuite été digérés par voie enzymatique à l'aide d'un cocktail de dispase (Life Technologies), de collagénase P et de DNaseI (Roche) pendant 45 min à 37 ° C pour obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules ont été comptées à l'aide d'un Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Pour la coloration des cytokines, les suspensions cellulaires ont été stimulées avec eBioscience Cell Stimulation Cocktail plus des inhibiteurs de transport de protéines (00-4975-93) remis en suspension dans du RPMI avec 10 % de FBS plus 2 mmol l–1 l-glutamine et 2-mercaptoéthanol pendant 2 h à 37 ° C Les cellules ont été marquées avec les anticorps monoclonaux suivants achetés auprès de BioLegend ou BD Biosciences à 4 ºC sur de la glace pendant 20 à 30 min, sauf indication contraire. Avant la coloration de la surface cellulaire avec les anticorps marqués par fluorescence suivants, les cellules ont été bloquées avec le bloc Fc (2.4G2 ; 1:200, 553142). Les anticorps de surface ou intracellulaires suivants ont été utilisés : CD45 (30-F11, 103139) ; EPCAM (G8.8, 118218); CD31 (390, 561410); PDPN (8.1.1, 127410) ; CD24 (M1/69, 612832); LRRC15 (M25, interne) ; CD90.2 (53-2.1, 565527); CD8 (53-6.7, 612759); PD1 (29F.1A12, 135225); TIM3 (RMT3-23, 119727); LAG3 (C9B7W, 125227); CD39 (Duha59, 143812); IFNγ (XMG1.2, 505846); granzyme B (GB11, 515408); et TNF (MP6-XT22, 506324). Les cellules vivantes ont été identifiées par incubation avec du bleu de calcéine (Invitrogen, C1429, 1:1 000) après coloration de surface. Pour la coloration intracellulaire, les échantillons ont été fixés, perméabilisés et colorés à l'aide d'un kit de fixation/perméabilisation BD Cytofix/Cytoperm (554714) conformément aux instructions du fabricant. Les données ont été acquises à l'aide d'un cytomètre en flux Fortessa, Symphony ou LSRII (BD Biosciences) et analysées à l'aide de FlowJo (Tree Star, v.10.7.1), ou les cellules ont été triées à l'aide d'un Fusion ou Aria (BD Biosciences). instrument Les données ont été traitées à l'aide de Prism GraphPad. Des informations supplémentaires sont fournies dans le tableau supplémentaire 6.

Pour la stimulation avec l'anti-CD3 lié à la plaque, des plaques à fond plat à 96 puits ont été recouvertes pendant une nuit à 4 ° C avec 10 µg ml-1 d'anti-CD3 (BioLegend, 100340, clone 145-2C11) et lavées une fois avec du PBS. Les CAF primaires pertinents ont été triés à partir de tumeurs sous-cutanées KPR digérées de souris DTR– ou DTR +, et 3 × 104 cellules ont ensuite été ajoutées au puits recouvert d'anti-CD3 (100 µl). Les cellules ont été incubées pendant 1 h à 37°C pour faciliter la fixation. Pendant l'incubation, les lymphocytes T CD8+ de souris ont été isolés à partir d'une suspension unicellulaire de splénocytes naïfs par sélection négative immunomagnétique à l'aide d'un kit d'enrichissement de lymphocytes T CD8+ EasySep Mouse de Stem Cell (19853) conformément aux directives du fabricant. Environ 6 × 104 cellules T CD8+ purifiées ont été ajoutées aux puits en présence de 0,50 µg ml–1 anti-CD28 soluble (BioLegend, 102115, clone 37.51) (100 µl). Le jour de l'analyse, le milieu a été remplacé et les cellules ont été cultivées avec 1 × Cell Stimulation Cocktail (eBioscience 500 × Cell Stimulation Cocktail plus inhibiteurs de transport de protéines, 00-4975) et 55 µM de 2-mercaptoéthanol pendant 4 h à 37 ° C. Les cellules ont été collectées, filtrées et colorées pour les marqueurs de surface. Après la coloration de surface, les cellules ont été fixées et perméabilisées avec un ensemble de tampons de fixation et de perméabilisation intracellulaires conformément aux directives du fabricant avant la coloration des cytokines intracellulaires. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie en flux.

Les tumeurs ont été fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4% et incorporées dans un milieu à température de coupe optimale (Sakura Finetek) et congelées pour stockage à -80 ° C. Les coupes (8 à 12 μm d'épaisseur) ont été cryosectionnées et colorées. Pour la coloration, les lames ont été bloquées et perméabilisées avec du sérum de souris normal (1:50), un bloc Fc de souris (1:100) et du Triton-X à 0,3% dilué dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Des coupes de tissus ont été incubées avec des anticorps primaires pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Après lavage, des anticorps secondaires ont été ajoutés pendant 1 h à température ambiante. Pour contre-colorer, les lames ont été rincées et incubées avec du DAPI (ThermoFisher, D1306) à 300 nM dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Les détails des anticorps utilisés peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 6. Les lames ont été rincées plusieurs fois dans du PBS, l'excès de tampon a été drainé et les sections ont été montées dans du Vectashield (H-1000). Les images ont été acquises avec un microscope confocal Nikon A1R équipé d'un objectif Plan apo lambda NA 0,75 × 20. Les lasers ont été réglés à excitation à 488 nm, 561 nm et 640 nm, et un module de mise au point parfaite. Le logiciel d'acquisition NIS Elements a été utilisé avec un zoom numérique de 2 pour l'imagerie de coupe complète de tissu ou de 7 pour les détails, et l'assemblage d'images à un seul plan a été effectué. Les estimations des taux d'interaction des lymphocytes T CD8 et des CAF LRRC15 ont été compilées entre les lymphocytes T et les CAF observés parmi les lymphocytes T totaux dans une section de tissu de 500 × 500 × 10 µm3 sur 3 tumeurs différentes.

Les tissus pour l'hybridation in situ ont été fixés au formol et inclus en paraffine. L'hybridation in situ de souris LRRC15 a été réalisée à l'aide d'une sonde ACD (Advanced Cell Diagnostics, 467838 avec 120 min d'hybridation. La récupération ER2 (Leica) à 95 °C pendant 15 min et la digestion RNAscope 2.5 LS Protease III (ACD) a été réalisée sur un Leica Bond RNAscope 2.5 LS Reagent Kit Red (ACD) a été utilisé pour la détection.

Le scRNA-seq de souris et le hachage cellulaire avec des anticorps à code-barres uniques (BioLegend) ont été traités à l'aide de la bibliothèque Chromium Single Cell Gene Expression 3 'v3 et d'un kit de billes de gel en suivant les instructions du fabricant (10x Genomics, PN-1000075). Les cellules ont été comptées et vérifiées pour leur viabilité à l'aide d'un compteur de cellules Vi-CELL XR (Beckman Coulter), puis injectées dans des puces microfluidiques pour former des billes de gel en émulsion dans un instrument 10x Chromium. La transcription inverse a été effectuée sur les billes de gel en émulsion, et les produits ont été purifiés et amplifiés. L'ADN des étiquettes dérivées d'anticorps a été séparé de l'ADNc sur la base de la sélection de la taille à l'aide de billes SPRIselect (Beckman Coulter, B23318). Des bibliothèques d'expression et des bibliothèques d'étiquettes dérivées d'anticorps ont été générées et profilées à l'aide d'un kit d'ADN Bioanalyzer High Sensitivity (Agilent Technologies, 5067-4626) et quantifiées avec un kit Kapa Library Quantification (Roche, 07960255001). Toutes les librairies ont été séquencées avec HiSeq4000 et NovaSeq (Illumina)

Les données scRNA-seq pour chaque bibliothèque de chaque type de cellule ont été traitées avec le comptage CellRanger (CellRanger 3.1, 10x Genomics) avec une référence personnalisée basée sur le génome de référence de la souris GRCm38 et les modèles de gène GENCODE. Le nombre d'anticorps de code-barres pour étiqueter les réplicats individuels a été traité à l'aide de DemuxEM avec des paramètres par défaut pour attribuer des étiquettes d'échantillon individuelles30. Les cellules identifiées comme des doublets ou des cellules HTO-négatives ont été exclues de l'analyse. Pour le comptage de l'expression génique, des échantillons individuels ont été fusionnés en une seule matrice d'expression et analysés à l'aide du package Seurat. Les cellules avec moins de 300 gènes exprimés ou plus de 5 % de mitochondries ont été éliminées. Les comptes de transcription ont été log-normalisés (Seurat, NormalizeData), et les 2 000 gènes les plus variables ont été sélectionnés à l'aide d'une transformation de stabilisation de la variance (FindVariableFeatures), suivie d'une mise à l'échelle des données (ScaleData). L'ACP a ensuite été réalisée sur cet espace génique (RunPCA). Le clustering a été effectué sur la base du voisin le plus proche partagé entre les cellules (FindNeighbors, 30 PC) et le clustering basé sur les graphes (30 PC, résolution de 0, 1 pour l'épuisement de Lrrc15, 0, 5 pour les expériences Tgfbr2 KO). Nous avons calculé les marqueurs pour les clusters individuels à l'aide de la fonction FindMarkers de Seurat (test de somme des rangs de Wilcoxon, ajustement de Benjamini-Hochberg pour les tests multiples). Pour visualiser les niveaux d'expression génique pour les grappes individuelles, nous avons calculé l'expression génique moyenne dans chaque grappe et calculé une valeur z-score par gène.

Pour les expériences DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl, les cellules de l'objet Seurat résultant de l'étape initiale de traitement des données ont été davantage filtrées en fonction de l'expression de marqueurs de type cellulaire connus. Seules les cellules fibroblastes des clusters 0, 2, 3, 4, 5 et 8 exprimant Lum et Dcn, mais pas Pecam1 (cellules endothéliales), Ptprc (cellules immunitaires) ou Rgs5 (péricytes), ont été retenues pour les analyses ultérieures. Nous avons ensuite effectué une réduction de dimensionnalité et un regroupement comme décrit ci-dessus et éliminé les cellules non fibroblastes contaminantes mineures restantes. La réduction de dimensionnalité finale et le regroupement ont été effectués à l'aide de 30 PC et d'une résolution de regroupement de 0,3.

Pour les expériences d'appauvrissement Lrrc15DTRGFP, les cellules fibroblastes (grappes 0, 1, 2 et 5) dans l'objet Seurat résultant de l'étape initiale de traitement des données ont été isolées en excluant les grappes exprimant Pecam1 (cellules endothéliales), Ptprc (cellules immunitaires), Rgs5 ( péricytes), Krt18 (épithéliales) ou Myl1 (cellules musculaires lisses). Nous avons ensuite effectué une réduction de dimensionnalité et un regroupement comme décrit ci-dessus et éliminé les cellules non fibroblastes contaminantes mineures restantes. La réduction de dimensionnalité finale et le regroupement ont été effectués à l'aide de 30 PC et d'une résolution de regroupement de 0,2.

Les cellules ont été notées pour les programmes d'expression génique à l'aide de la fonction addModuleScore dans Seurat et d'un ensemble de gènes d'intérêt en entrée. Les programmes GEMM de souris PDAC ont été dérivés comme suit. Nous avons utilisé des gènes avec une régulation à la hausse moyenne d'au moins 0,6 log dans les CAF TGFβ (groupe 2) de notre étude précédente1 comme gènes marqueurs pour ces conditions. Pour identifier un ensemble de gènes de fibroblastes de tissus normaux (grappes 3 et 4), nous avons identifié les 20 principaux marqueurs pour les grappes 3 et 4 et les avons comparés à toutes les autres cellules de l'ensemble de données à l'aide de la fonction FindMarkers de Seurat.

Pour évaluer les différences d'abondance de cellules à partir de grappes spécifiques entre les conditions, nous avons utilisé le paquet R speckle (https://github.com/Oshlack/speckle), qui est conçu pour trouver des différences significatives dans les proportions de type cellulaire. En bref, le chatoiement calcule la fraction de cellules affectées à un groupe particulier dans chaque réplique biologique, effectue une transformation de stabilisation de variance sur les proportions et détermine si les proportions de type cellulaire sont significatives entre différents groupes. Étant donné que nous n'avons comparé que deux groupes dans toutes nos expériences, le test t a été utilisé par speckle pour calculer les valeurs P, qui ont été ajustées pour des tests multiples à l'aide de la correction de Benjamini-Hochberg.

Nous avons utilisé PROGENy17 pour déduire l'activité de la voie à partir de nos données d'expression génique unicellulaire comme décrit précédemment10 et en suivant le didacticiel unicellulaire fourni par les auteurs (https://saezlab.github.io/progeny/articles/ProgenySingleCell.html). Nous avons apparié les scores de progéniture avec les grappes ou le moment/la condition expérimentale et avons résumé les données par population.

Les fragments normalisés par kilobase de séquence par million de valeurs de lecture cartographiées ont été extraits du tableau supplémentaire 6 dans la réf. 12. Les données ont été transformées en log et les niveaux d'expression de Lrrc15 et Gapdh ont été visualisés par tissu.

Les données d'ARNm TCGA Pan-Cancer normalisées et corrigées par lots ont été obtenues à partir de UCSC Xenabrowser (https://xenabrowser.net/) (N = 11 060). Les échantillons contenant des valeurs d'expression de NA ont été supprimés. Nous avons en outre filtré les données pour ne contenir que des échantillons de tumeurs solides primaires (code d'échantillon 01 ; N = 9 702). Les données de survie ont été obtenues à partir du tableau S1 dans la réf. 31 et lié à l'ensemble de données Pan-Cancer à l'aide du code à barres unique du participant TCGA. Les indications avec moins de 80 patients ont été exclues de l'analyse (ensemble de données final : N = 9 195 patients). Les niveaux de TGFB CAF ont été déduits en calculant l'expression moyenne de notre signature de marqueur précédemment publiée1 dans un échantillon après transformation du score z de chaque gène dans les échantillons. L'association avec la survie à travers les données TCGA a été déterminée avec une régression multivariée de Cox et l'indication TCGA comme covariable, ainsi qu'une analyse de régression univariée de Cox dans chaque indication. Le rapport de risque a été défini comme la variation du risque de décès si le score TGFβ CAF augmentait d'une unité.

Des échantillons de tumeurs pour l'Immunoprofiler Initiative (IPI) ont été transportés de diverses salles d'opération oncologiques et de cliniques externes. Tous les patients ont donné leur consentement au groupe de coordination clinique IPI de l'Université de Californie à San Francisco (UCSF) pour la collecte de tissus selon un protocole UCSF approuvé par le comité d'examen institutionnel (UCSF IRB 20-31740). Des échantillons ont été obtenus après exérèse chirurgicale avec des biopsies réalisées par des assistants en pathologie pour confirmer la présence de cellules tumorales. Les patients ont été sélectionnés sans tenir compte du traitement antérieur. Les échantillons fraîchement réséqués ont été placés dans du PBS glacé ou du milieu L-15 de Leibovitz dans un tube conique de 50 ml et immédiatement transportés au laboratoire pour étiquetage et traitement des échantillons. Des échantillons ont été utilisés pour la digestion de tissus entiers dans une suspension unicellulaire ou une partie du tissu a été tranchée et conservée pour l'analyse par imagerie.

Le tri cellulaire, la préparation de la bibliothèque, le séquençage et le traitement des données bioinformatiques ont été effectués comme décrit précédemment32.

À partir de la matrice log-transformée des valeurs d'expression gène × cellule normalisées, nous avons identifié les 2 500 gènes les plus variables en fonction de leur intervalle interquartile et effectué une PCA dans l'espace de ces gènes. Nous avons ensuite utilisé les 10 gènes les plus fortement chargés positivement et négativement de PC1 à PC6 pour le regroupement hiérarchique des échantillons et des gènes (liaison complète et distance euclidienne). Le dendrogramme des grappes a été divisé en k = 6 grappes en fonction de la hauteur des arbres. Nous avons interprété des groupes d'échantillons avec une expression élevée d'EPCAM, de KRT8 et de KRT18 comme étant axés sur l'épithélium et TYROBP et CSF3R comme étant axés sur la myéloïde et avons exclu ces échantillons de notre analyse ultérieure. Ensuite, nous avons effectué une PCA sur les échantillons restants. Les chargements de l'espace PC résultant ont ensuite été utilisés pour projeter les échantillons épithéliaux et myéloïdes sur PC1 et PC2. De même, des échantillons d'ARN-seq en vrac microdisséqués provenant de patients atteints de PDAC, comme indiqué dans la réf. 33 ont été obtenus à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (identifiant GSE93326) et projetés sur PC1 et PC2.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les ensembles de données brutes et traitées de scRNA-seq sont disponibles dans le référentiel ArrayExpress sous les numéros d'accès E-MTAB-12028 et E-MTAB-12036. Les données d'ARN-seq en masse des cellules stromales humaines sont disponibles dans la base de données European Genome – Phenome Archive sous l'accession EGAD00001009176. Les données sources sont fournies avec ce document.

Aucun nouvel algorithme n'a été développé pour ce manuscrit. Tout le code généré pour l'analyse est disponible auprès des auteurs sur demande.

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Nous remercions les membres du laboratoire Turley pour la discussion et l'assistance expérimentale et le personnel de l'installation de Genentech pour l'entretien du vivarium et l'assistance de l'installation de base. L'acquisition et les analyses de certains échantillons humains décrits dans cette étude ont été menées par l'UCSF et partiellement financées par les contributions d'AbbVie, Amgen, Bristol-Myers Squibb, Genentech et Pfizer dans le cadre de l'UCSF IPI. Des illustrations de souris, d'humains et de cellules ont été créées avec BioRender.com. Ce travail a été soutenu par Genentech.

Genentech, South San Francisco, Californie, États-Unis

Akshay T. Krishnamurty, Justin A. Shyer, Minh Thai, Vineela Gandham, Matthew B. Buechler, Yeqing Angela Yang, Rachana N. Pradhan, Amber W. Wang, Patricia L. Sanchez, Yan Qu, Beatrice Breart, Cécile Chalouni, Debra Dunlap, James Ziai, Justin Elstrott, Neelie Zacharias, Weiguang Mao, Rebecca K. Rowntree, Jack Sadowsky, Gail D. Lewis, Thomas H. Pillow, Barzin Y. Nabet, Romain Banchereau, Lucinda Tam, Roger Caothien, Natasha Bacarro, Merone Roose-Girma, Zora Modrusan, Sanjeev Mariathasan, Sören Müller & Shannon J. Turley

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Conceptualisation : ATK, S. Müller. et Méthodologie SJT : ATK, S. Müller. et SJT Software, analyse formelle et conservation des données : AWW et S. Müller. Enquête : ATK, JAS, MT, VG, MBB, YAY, RNP, PLS, YQ, BB, CC, DD, JZ, JE, NZ, WM, RKR, JS, GDL, THP, BYN, RB, LT, RC, NB, MR-G., ZM et S. Mariathasan. Rédaction : ATK, S. Müller. et visualisation SJT : ATK, MT, CC, RNP, JZ et S. Müller. Direction : S. Müller. et SJT

Correspondance à Sören Müller ou Shannon J. Turley.

Tous les auteurs sont des employés de Genentech Inc., membre du groupe Roche.

Nature remercie Mara Sherman et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

un. À partir de tumeurs KPR sous-cutanées 21 jours après l'implantation chez des souris Dptwt/wtRosa26LSLYFP+/- et Dptki/kiRosa26LSLYFP+/- montrant des tracés représentatifs de cytométrie en flux (à gauche) et la quantification de la fréquence (à droite) des cellules Dpt-YFP+ dans des fibroblastes PDPN+CD31– (n = 6 souris). bi. À partir de tumeurs KPR sous-cutanées 21 jours après l'implantation chez des souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl et Dptki/kiTgfbr2fl/fl après le régime expérimental de la Fig. 1a montrant b. Histogramme représentatif de cytométrie en flux (à gauche) et quantification de la fréquence (à droite) des cellules TGFβR2 + dans les fibroblastes PDPN + CD31– (n = 10 souris). c. Stratégie de gating pré-tri représentative (à gauche) et analyse de pureté post-tri (à droite) des cellules stromales CD24-CD45- et des cellules immunitaires CD45 + d. Parcelle UMAP de 10 136 stroma et cellules immunitaires colorées par l'appartenance au cluster (à gauche), l'expression du gène marqueur (au milieu) et la fréquence des échantillons de cellules individuelles hachées dans les clusters de l'UMAP (n = 5 souris par groupe). e. Graphiques de violon montrant le score d'une signature génétique Tgfb CAF PDAC GEMM pour les cellules de chaque groupe de la Fig. 1e. f, g. UMAP comme sur la figure 1f, colorées par l'expression des marqueurs indiqués. h. Fraction de cellules dans chaque groupe de chaque condition de la Fig. 1e (n = 5 animaux par condition). je. Scores pour le même ensemble de gènes que dans e, ici pour les cellules du cluster proliférant (C4) de la Fig. 1e et divisés par condition. Les données en a, b sont regroupées à partir de deux ou trois expériences indépendantes. Les données dans a,b sont moyennes +/− sd et dans h sont moyennes + sem Les statistiques dans a,b,h ont été calculées à l'aide d'un test t de Student bilatéral non apparié.

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un. Stratégie d'analyse des populations CAF triées à partir de tumeurs humaines : À gauche : l'ACP a été réalisée sur tous les échantillons et les 20 gènes de charge les plus fortement positifs et négatifs de chaque PC ont été extraits. Au milieu : un regroupement hiérarchique a été effectué et des échantillons sans aucune contamination ont été isolés. À droite : une PCA a été réalisée sur ces échantillons purs. Des échantillons avec certaines contaminations ont été projetés dans cet espace PCA obtenu à partir d'échantillons purs pour dériver la Fig. 1l. b. Distribution des tissus adjacents normaux (N) et tumoraux (T) le long de PC1 de la Fig. 1l. c. Projection de 123 échantillons d'ARN-seq PDAC microdisséqués dans l'espace PCA obtenus à la Fig. 1b. d. Même parcelle forestière que sur la Fig. 1p, ici pour toutes les indications de cancer dans TCGA. Dans les données en b, c, les moustaches représentent le minimum et le maximum, la boîte représente l'IQR et la ligne centrale représente la médiane. Dans les données en d, le point central indique le rapport de risque et les lignes représentent l'intervalle de confiance à 95 %. Les statistiques ont été calculées à l'aide d'un modèle de régression des risques proportionnels de Cox en d.

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un. Quantification de la fréquence des cellules LRRC15+ dans les tumeurs KPR sous-cutanées 17 jours après l'implantation dans les fibroblastes PDPN+, les cellules endothéliales sanguines CD31+ (BEC), les cellules stromales PDPN-CD31-, les cellules immunitaires CD45+ et les cellules tumorales CD24+ (n = 10 souris). b. Images représentatives d'hybridation in situ LRRC15 de tissus murins sains sélectionnés et de tissus tumoraux KPR sous-cutanés 17 jours après l'implantation. c. Données RNAseq en masse de 17 tissus de souris normaux montrant l'expression de Lrrc15 et Gapdh (contrôle). Le nombre d'échantillons par tissu figure dans les données sources. df. Expression des gènes Fap, Acta2 et Lrrc15 de d. Analyse scRNAseq de fibroblastes, de cellules immunitaires, de cellules endothéliales et de péricytes de tumeurs KPR 21 jours après l'implantation chez des souris Dptwt/wtTgfbr2fl/fl. e. scRNAseq de fibroblastes Pdgfrα + à l'état d'équilibre dans les tissus murins. F. scRNAseq de fibroblastes et de péricytes de ganglions lymphatiques murins naïfs drainant la peau avec l'expression de Ccl19. Les données de a sont regroupées à partir de trois expériences indépendantes. Les données en b sont représentatives d'une expérience indépendante. Les données en a sont moyennes +/- sd Dans les données en c, les moustaches représentent le minimum et le maximum, la boîte représente l'IQR et la ligne centrale représente la médiane. Les statistiques dans a ont été calculées à l'aide d'un test ANOVA unidirectionnel ordinaire.

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un B. À partir de tumeurs KPR sous-cutanées 8 jours après le traitement par PBS ou DT chez des souris DTR– et DTR+. un. Parcelles représentatives de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules LRRC15 + dans les fibroblastes PDPN + CD31– et b. Quantification du nombre total de cellules PDPN + LRRC15 + normalisées par le poids de la tumeur (n = 6 souris) c. Quantification de la fréquence des cellules PDPN+LRRC15+ (gauche) et PDPN+CD31– fibroblastes (droite) aux jours 7 (n = 8 ou 9 souris), 14 (n = 10 souris) et 21 (n = 10 souris) après DT traitement chez des souris porteuses de tumeur KPR sous-cutanée DTR– et DTR+. d. Courbes de variation du poids corporel des souris DTR– et DTR+ traitées avec DT (n = 9 ou 11 souris/groupe). Changement de poids corporel moyen chez tous les animaux (à gauche); Courbes de changement de poids corporel individuel par génotype (à droite). L'axe X représente les jours après le traitement DT. Les données en b, c sont regroupées à partir de deux ou trois expériences indépendantes. Les données en d sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les données en b,c,d sont des moyennes +/- sd Les statistiques ont été calculées à l'aide d'un test ANOVA ordinaire à un facteur en b et d'un test ANOVA ordinaire à deux facteurs en c.

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un. Stratégie de gating pré-tri représentative (à gauche) et analyse de pureté post-tri (à droite) des cellules stromales du tissu tumoral KPR sous-cutané (en haut) ou du tissu cutané naïf (en bas). b. Graphique UMAP de 54 240 cellules stromales colorées par l'appartenance au cluster (à gauche). UMAP comme à gauche, ici coloré par l'expression du gène marqueur indiqué (au milieu) et la fréquence des échantillons de cellules individuelles hachées en grappes de l'UMAP (à droite). Expression moyenne relative des 5 meilleurs gènes marqueurs dans chaque groupe (en bas). c. UMAP (D0,7,14,21 ; gauche, D7,14,21 ; droite) comme dans 3b divisé coloré par l'expression de Cxcl12. d. Fraction de cellules dans C1, C2 et C5 de la Fig. 3b dans chaque condition (n = 5 animaux/condition) aux quatre points dans le temps dans des échantillons porteurs de tumeur. e. Graphiques de violon montrant le score d'une signature génétique de peau naïve C3 / C4 pour les cellules de chaque groupe de la figure 3b. F. Scores d'enrichissement de la voie PROGENY (couleur) pour les cellules regroupées pour chaque groupe de la Fig. 3b. Les données en d sont moyennes + sem Les statistiques en d ont été calculées à l'aide d'un test t de Student bilatéral non apparié.

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un. Courbes de croissance tumorale individuelles provenant de souris KPR sous-cutanées traitées au DT portant des souris DTR– et DTR + en combinaison avec un anticorps anti-CD8 ou un contrôle isotypique (n = 10 souris / groupe). La ligne rouge pointillée représente l'ajustement de référence moyen du groupe témoin (isotype DTR– +). b. Analyse par immunofluorescence de tumeurs KPR sous-cutanées colorées pour LRRC15 et CD8 (à gauche) et quantification de la fréquence des lymphocytes T CD8+ à moins de 2 µm d'un CAF LRRC15+. CD. Schéma expérimental (c) et stratégie de tri (d) pour l'expérience de co-culture de cellules T CAF-CD8 + pour les résultats en 4f. e, f. À partir d'une tumeur KPR sous-cutanée traitée par DT portant des souris DTR– et DTR + en combinaison avec un anticorps aPDL1 ou un contrôle isotypique e. Deux études indépendantes montrant des courbes de croissance tumorale individuelles (Étude 1 : n = 9 ou 10 souris/groupe ; Étude 2 : n = 9 ou 11 souris/groupe). La ligne rouge pointillée représente l'ajustement de référence moyen du groupe témoin (isotype DTR– +). F. Analyse de survie du temps jusqu'à progression vers des volumes tumoraux atteignant 1000 m3 ou une ulcération tumorale supérieure à 5 mm (n = 9 ou 10 souris/groupe). Les données en b sont des moyennes +/- sem Les données en a,f sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les statistiques en f ont été calculées à l'aide d'un test Log-rank Mantel-Cox.

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a–e. À partir de souris DTR– et DTR+ portant une tumeur orthotopique pancréatique KPR traitée par DT en combinaison avec un anticorps aPDL1 ou un isotype témoin a. Images échographiques représentatives des tumeurs pancréatiques KPR dans tous les groupes de traitement et à tous les moments. La ligne bleue hachurée marque la circonférence de la tumeur. b. Courbes individuelles de croissance tumorale (n = 7 souris/groupe). La ligne rouge pointillée représente l'ajustement de référence moyen du groupe témoin (isotype DTR– +). c. Parcelles représentatives de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules LRRC15 + dans les fibroblastes PDPN + CD31– d, e. Quantification du nombre total de cellules PDPN + LRRC15 + (d) et de cellules PDPN + CD31 + (e) normalisées par le poids de la tumeur (n = 5 souris). Les données en d,e sont des moyennes +/- sd Les données en ae sont représentatives d'une expérience indépendante. Les statistiques en d,e ont été calculées à l'aide d'un test ANOVA unidirectionnel ordinaire.

Données source

Marqueurs de toutes les cellules pour l'expérience DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq.

Marqueurs de fibroblastes pour l'expérience DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq.

Information des patients pour la cohorte IPI.

Marqueurs pour toutes les cellules pour l'expérience Lrrc15DTR kinetic scRNA-seq.

Marqueurs pour les fibroblastes pour l'expérience Lrrc15DTR kinetic scRNA-seq.

Informations sur les anticorps utilisés dans ce manuscrit.

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Réimpressions et autorisations

Krishnamurty, AT, Shyer, JA, Thai, M. et al. Les myofibroblastes LRRC15 + dictent le point de consigne stromal pour supprimer l'immunité tumorale. Nature 611, 148-154 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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Reçu : 14 juillet 2021

Accepté : 24 août 2022

Publié: 28 septembre 2022

Date d'émission : 03 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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